Fyrir algenga petrídiska með glerbotni á markaðnum er venjulega gert gat neðst á petrídiski úr plasti og síðan er hlífðargler eða frumuglas með þykkt 170-220 μm límt á botn petrískál með skuggalausu lími eða kísilgeli. Ekki er allur botninn á petrífatinu úr gleri. Svæðið sem hentar til athugunar er aðeins á götunarsvæðinu. Hins vegar, vegna vatnsfælni glers, þegar frumur eru ræktaðar, geta frumurnar ekki fest sig vel við glerið, og vaxtarástandið er ekki gott, og jafnvel fyrirbæri frumuaflögunar á sér stað meðan á confocal skönnun myndatöku stendur.
Til þess að frumur haldist vel er nauðsynlegt að staðfesta að sérstök próteinhvarfefni hafi verið húðuð áður en glerbotndiskar eru notaðir til frumuræktunar.
gera-það-sjálfur teppi
Mismunandi frumuræktir þurfa mismunandi húðunarhvarfefni. Á sama tíma, vegna þess að próteinið sem notað er til húðunar er líffræðileg vara, er hreinleiki vöru og skammtur af húðunarpróteini mismunandi fyrirtækja mismunandi. Þessi tæknilega færsla er aðeins til viðmiðunar. Sérstakur skammtur húðunarhvarfefna ætti að vísa til leiðbeininga vörumerkja sem notuð eru. . Og það er best að gera hallatilraun með hvarfefnum sem þú notar til að finna heppilegasta húðunarstyrkinn.
Hér er dæmi um Poly-L-Lysine (PLL, sigma, P4832, 100ug/ml):
PLL húðun hentar langflestum frumum, sérstaklega fyrir ræktun taugafrumna í miðkerfinu. Nauðsynlegt er að búa til próteininnihald (ug/cm2) á hverja flatarmálseiningu til að ná æskilegu magni við notkun. Ráðlagt magn af húðun fyrir PLL í þessu dæmi er 2 ug/cm2. Nauðsynlegt er að reikna út magn próteins sem þarf í samræmi við yfirborð húðunar og rúmmál húðunar.
Til dæmis: 35 mm petrískál úr glerbotni, frumuvaxtarsvæðið er 3,5 cm2, húðunarsvæðið er 4,1 cm2 og rúmmál húðunarlausnarinnar er 400 ul, þá er ráðlagður skammtur 2ug/cm2. Þá þarf 8,2 ug af PLL í einni brunn. Ef aðeins 400 ul af PLL lausn er bætt við er styrkur PLL lausnar 20,5 ug/ml (um 20 ug/ml). Þess vegna þarf að þynna stofnlausnina með ofurhreinu vatni.
Sérstök skref:
1. Þynntu PLL stofnlausnina 1:5 með ofurhreinu vatni.
2. Bætið 400 ul af PLL þynningu í hvern 35 mm glerbotna petrískál.
3. Ræktið í 1-2 klukkustundir við stofuhita og sogið PLL þynninguna út.
4. Þvoið varlega þrisvar sinnum með 2ml af PBS lausn eða sermilausu miðli og sogið upp þvottalausnina.
5. Bætið frumusviflausninni beint við til ræktunar.
Aðferðarmat
Vegna mismunandi eiginleika ýmissa húðunarpróteina eru mismunandi húðunarprótein notuð á mismunandi hátt. Ný mengun verður oft til vegna þess að þörf er á að húða diska með glerbotni. Þar að auki uppgötvast mengun oft eftir að frumurnar hafa verið hækkaðar, sem tefur ekki aðeins tíma heldur eyðir einnig rekstrarvörum úr settinu. Þegar öllu er á botninn hvolft eru húðuð próteinhvarfefni og gæðatryggðir diskar með glerbotni dýrir (glerbotna diskar af lélegum gæðum geta lekið vegna þess að límið er ekki klístrað eða límið sem er notað er eitrað fyrir frumur).
Confocal Petri diskar án húðunar
Fyrir börn sem vilja spara tíma og fyrirhöfn er þægilegra að nota confocal menningarrétti án húðunar.
Þættir sem þarf að hafa í huga þegar hentugur ræktunarréttur er valinn eru: hvort það henti eigin frumum að halda sig við, hvort sjónseiginleikar ræktunardisksins uppfylli þær kröfur sem gerðar eru til ræktunar.
Petrí diskar sem uppfylla kröfur ofangreindra þátta takmarkast ekki við húðaða diska með glerbotni. Reyndar vita allir að plastdiskar eru ódýrari og auðveldara fyrir frumur að festast við en gler. Hér er dæmi um confocal ræktunarrétt frá Shanghai Jingan, til að tala um þær breytur sem ræktunarréttur sem hentar fyrir confocal tilraunir þarf að hafa:
Það má sjá að eðlisfræðilegar breytur confocal ræktunarrétta sem uppfylla kröfur um beina notkun eru mjög nálægt gleri, en á sama tíma hafa þeir einnig vatnssækna eiginleika, sem geta gert flestar frumur betri viðloðun; og sveigjanleiki er betri en gler. Það gerir flestum frumulínum og frumfrumum kleift að festast beint við vegginn og er ekki viðkvæmt, sem er góður kostur.
Þú getur líka fundið heppilegasta confocal ræktunarréttinn fyrir tilraunina þína í samræmi við sérstakar tilraunakröfur þínar og breyturnar í töflunni hér að ofan.
Aðferðarmat
Að velja þessa tegund af petrískál þarf ekki viðbótarhúð, sem dregur verulega úr hættu á mengun. Og þar sem auðveldara er að vinna með plastbotninn þarf ekkert lím til að festa hann við botninn á petrífatinu. Útrýma möguleikanum á leka eða frumueiturhrifum.
